摘要

本文詳細闡述了柔嫩艾美耳球蟲ADF重組卡介苗的構(gòu)建及其免疫保護性研究。通過RT-PCR技術(shù)擴增ADF基因，并克隆至卡介苗表達載體中，構(gòu)建了重組卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF。實驗結(jié)果顯示，重組卡介苗通過滴鼻免疫方式具有顯著的抗球蟲效果，為雞球蟲病的預(yù)防提供了新的策略。

引言

雞球蟲病是一種由艾美耳屬球蟲寄生在雞的腸道引起的寄生性原蟲病，其中柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）是最主要的病原體之一。該病分布廣泛，感染率高達60%～70%，死亡率可超過80%，對養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前，預(yù)防和治療雞球蟲病的主要措施是使用化學(xué)藥物和抗球蟲疫苗。然而，藥物殘留問題和對環(huán)境的污染限制了化學(xué)藥物的使用，而現(xiàn)有的疫苗免疫效果并不理想。因此，開發(fā)新型高效的疫苗成為雞球蟲病防控的重要研究方向。

重組卡介苗（rBCG）作為一種致弱的活疫苗，具有較強的免疫佐劑作用，是表達外源基因的理想活菌疫苗載體。ADF（Actin Depolymerizing Factor）蛋白與柔嫩艾美耳球蟲入侵雞的腸上皮細胞有關(guān)，可以結(jié)合肌動蛋白，是潛在的疫苗候選抗原。本研究旨在構(gòu)建柔嫩艾美耳球蟲ADF基因重組卡介苗，并評估其免疫保護效果，為雞球蟲病的預(yù)防提供新的策略。

材料與方法

1. 實驗材料

• 菌株與質(zhì)粒：大腸桿菌DH5α、卡介苗BCG、穿梭表達載體pMV261和整合表達載體pMV361。

• 試劑：某品牌RNA提取試劑、某品牌RT-PCR試劑盒、某品牌限制性內(nèi)切酶、某品牌T4 DNA連接酶、某品牌質(zhì)粒提取試劑盒、某品牌IPTG、某品牌SDS-PAGE試劑盒等。

• 實驗動物：SPF級雛雞。

2. 方法

• ADF基因的克隆：從柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊中提取總RNA，使用RT-PCR技術(shù)擴增ADF基因的完整開放閱讀框（ORF），并克隆至pMD18-T載體中，進行測序驗證。

• 重組質(zhì)粒的構(gòu)建：將ADF基因分別克隆至穿梭表達載體pMV261和整合表達載體pMV361中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMV261-ADF和pMV361-ADF。使用限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，T4 DNA連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，篩選陽性克隆并進行測序驗證。

• 重組卡介苗的構(gòu)建：將重組質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化至卡介苗BCG中，篩選陽性重組卡介苗。

• 動物免疫實驗：將構(gòu)建的重組卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF疫苗通過滴鼻、口服、頸部皮下注射三種途徑接種SPF級雛雞，BCG免疫組作為對照。免疫后經(jīng)口接種柔嫩艾美耳球蟲卵囊，觀察并記錄雞的發(fā)病情況、盲腸病變、卵囊產(chǎn)量等指標。

• 免疫效果評價：通過抗球蟲指數(shù)（ACI）評價重組卡介苗疫苗的保護效果。同時，取免疫雞的血清用ELISA方法檢測抗體水平，取雞的脾臟測定脾淋巴細胞內(nèi)CD4+T、CD8+T細胞的百分率變化情況。

實驗結(jié)果

1. ADF基因的克隆與測序

   成功從柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊中擴增出ADF基因的完整ORF，大小為357bp，編碼118個氨基酸。測序結(jié)果與已報道的序列完整一致，說明ADF基因在不同種和不同地理株間均具有高度的保守性。

2. 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與測序

   成功將ADF基因克隆至穿梭表達載體pMV261和整合表達載體pMV361中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMV261-ADF和pMV361-ADF。測序結(jié)果顯示，ADF基因正確插入載體中，且載體序列完整無誤。

3. 重組卡介苗的構(gòu)建與篩選

   成功將重組質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化至卡介苗BCG中，篩選獲得陽性重組卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF。通過PCR和測序驗證，確認ADF基因已正確整合至卡介苗基因組中。

4. 動物免疫實驗與免疫效果評價

   將構(gòu)建的重組卡介苗通過滴鼻、口服、頸部皮下注射三種途徑接種SPF級雛雞。結(jié)果顯示，滴鼻免疫方式的抗球蟲效果好。重組卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF的ACI值分別為161.47和169.21，顯著高于BCG免疫組（P<0.01）。同時，免疫雞的抗體水平顯著升高，CD4+T淋巴細胞的百分率也顯著增加（P<0.01）。

   為進一步驗證IL-2基因?qū)χ亟M卡介苗免疫效果的增強作用，將雞的IL-2基因與ADF基因同時克隆入載體中，制備兩株重組卡介苗pMV261-ADF-IL-2和pMV361-ADF-IL-2。體外試驗表明，滴鼻方式免疫pMV261-ADF-IL-2和pMV361-ADF-IL-2的抗球蟲指數(shù)ACI可達到176.08和172.89，其抗體水平和CD4+T、CD8+T淋巴細胞百分率與對照組相比差異均極顯著（P<0.01）。

討論

1. ADF基因作為疫苗候選抗原的潛力

   ADF蛋白與柔嫩艾美耳球蟲入侵雞的腸上皮細胞有關(guān)，是潛在的疫苗候選抗原。本研究成功構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲ADF基因重組卡介苗，并通過動物免疫實驗驗證了其顯著的抗球蟲效果。這表明ADF基因作為疫苗候選抗原具有巨大的潛力。

2. 重組卡介苗的免疫佐劑作用

   重組卡介苗作為一種致弱的活疫苗，具有較強的免疫佐劑作用。本研究中，重組卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF通過滴鼻免疫方式顯著提高了雞的抗球蟲指數(shù)，抗體水平和CD4+T淋巴細胞的百分率也顯著增加。這表明重組卡介苗在雞球蟲病預(yù)防中具有顯著的免疫佐劑作用。

3. IL-2基因?qū)χ亟M卡介苗免疫效果的增強作用

   IL-2是細胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)（CMI）的主要細胞因子，由TH-1型細胞產(chǎn)生。本研究中將雞的IL-2基因與ADF基因同時克隆入載體中，制備了兩株重組卡介苗pMV261-ADF-IL-2和pMV361-ADF-IL-2。結(jié)果顯示，IL-2基因能顯著提高重組卡介苗的抗球蟲指數(shù)、抗體水平和CD4+T、CD8+T淋巴細胞百分率。這表明IL-2基因?qū)χ亟M卡介苗的免疫效果具有顯著的增強作用。

4. 研究的創(chuàng)新與應(yīng)用前景

   本研究構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲ADF基因重組卡介苗，并評估了其免疫保護效果。通過動物免疫實驗驗證了其顯著的抗球蟲效果，為雞球蟲病的預(yù)防提供了新的策略。同時，本研究還探討了IL-2基因?qū)χ亟M卡介苗免疫效果的增強作用，為進一步優(yōu)化疫苗提供了新思路。未來，本研究成果有望應(yīng)用于雞球蟲病的防控實踐中，為養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展提供有力保障。

結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲ADF基因重組卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF，并通過動物免疫實驗驗證了其顯著的抗球蟲效果。同時，本研究還探討了IL-2基因?qū)χ亟M卡介苗免疫效果的增強作用。結(jié)果表明，ADF基因作為疫苗候選抗原具有巨大的潛力，重組卡介苗在雞球蟲病預(yù)防中具有顯著的免疫佐劑作用，IL-2基因能顯著提高重組卡介苗的免疫效果。本研究為雞球蟲病的預(yù)防提供了新的策略，為養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展提供了有力保障。未來，將進一步優(yōu)化疫苗制備工藝，提高疫苗的穩(wěn)定性和免疫效果，為雞球蟲病的防控實踐提供更為有效的解決方案。